Nationales Referenzzentrum für Clostridioides (Clostridium) difficile am UKS

Bei allen Einsendungen muss der Materialeinsendeschein ausgefüllt werden. Zudem muss die Meldepflicht nach §6 IfSG beachtet und der 2D-Barcode der DEMIS-Meldung an das Referenzzentrum weitergeleitet werden. Damit können unsere Typisierungsdaten direkt mit der Meldung verknüpft werden.

Entsprechend den Leitlinien der European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID) wird als Diagnostikalgorithmus zunächst ein Suchtest mit hoher Sensitivität wie Glutamatdehydrogenase (GDH) oder eine Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) zur Detektion des Toxin-B-Gens (cdtB) empfohlen (1). Zum Nachweis einer Toxinproduktion auf Proteinebene ist zusätzlich ein Test auf das Vorhandensein von Toxin mittels ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) beziehungsweise CLIA (Chemilumineszenz-Immunoassay) oder eine toxigene Kultur empfehlenswert (1). Insbesondere der Toxinnachweis kann je nach Dauer zwischen Abnahme und Bearbeitung durch das Labor häufig falsch negativ ausfallen (2). Ein positiver Suchtest bei negativem Toxinnachweis sollte daher nicht die Therapie bei passender Klinik unnötig verzögern.

In manchen Fällen kann es sinnvoll sein, mit einem dritten Bestätigungsverfahren eine mögliche Infektion nachzuweisen (1). Bei einem Diagnostikalgorithmus zum Beispiel von GDH gefolgt von einer Toxinbestimmung kann eine PCR (oder die toxigene Kultur) zur Klärung bei negativem Toxinnachweis beitragen. Die Verlaufskontrollen sind rein klinisch, sodass Nachtestungen nicht sinnvoll sind. Auch die Testung asymptomatischer Patientinnen und Patienten ist nicht indiziert. Im Nationalen Referenzzentrum für Clostridioides (Clostridium) difficile ist die Typisierung von Isolaten schwerer gemeldeter klinischer Verläufe kostenlos.

Quellen
1. Crobach MJ, Planche T, Eckert C, Barbut F, Terveer EM, Dekkers OM, et al. European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases: update of the diagnostic guidance document for Clostridium difficile infection. Clin Microbiol Infect. 2016;22 Suppl 4:S63-81.

2. Davies KA, Longshaw CM, Davis GL, Bouza E, Barbut F, Barna Z, et al. Underdiagnosis of Clostridium difficile across Europe: the European, multicentre, prospective, biannual, point-prevalence study of Clostridium difficile infection in hospitalised patients with diarrhoea (EUCLID). Lancet Infect Dis. 2014;14(12):1208-19.

Es gab Rückfragen aus den Landesstellen zu den aktuellen Typisierungsmethoden von C. difficile und der damit verbundenen Nomenklatur. Mit der dynamischen Entwicklung von molekulargenetischen Methoden hat sich in den vergangenen Jahrzehnten auch die Genotypisierung von Bakterien verändert. Ausgehend Banden-basierten Methoden (z.B. Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE)) entwickelten sich sequenzbasierte Methoden von single-locus-sequence-typing, SLST) über multiple-locus-sequence-typing (MLST) bis zur Ganzgenomsequenzierung. Mit der MLST konnten anders als bei früheren Typisierungsmethoden erstmals nicht nur Unterschiede zwischen Stämmen sondern auch genetische Verwandtschaften analysiert werden. Für die Genotypisierung von C. difficile wurden in den 2000er Jahren verschiedene Typisierungsmethoden nahezu gleichberechtigt eingesetzt: PFGE, das SLST (Surface-layer protein A, slpA), MLST, multiple-locus variable number of tandem repeats (MLVA) und die PCR-Ribotypisierung. International setzte sich die Ribotypisierung als Standardmethode durch, da sie besonders gut geeignet war die häufigsten Stämme einschließlich des neuen Hypervirulenten Ausbruchsstamms Ribotyp 027 (PFGE Muster NAP-1) zu identifizieren. Als einfache, Banden-basierte Methode kann aber mit der PCR-Ribotypisierung keine Verwandtschaft zwischen Stämmen berechnet werden und auch die Benennung und das Erkennen von neuen Ribotypen ist nur eingeschränkt möglich. Mit der ransanten Entwicklung neuer Sequenziermethoden wurde in den vergangenen Jahren die Ganzgenomsequenzierung für die Genotypisierung der gesamten Bakteriologie zum allgemeinen Goldstandard. Sie erlaubt die Einteilung in Verwandtschaftsbäume mit Claden, Sequenztypen (ST), cgMSLT sowie in der Charakterisierung einzelner Gene (Resistenzgene, Virulenzgene, etc.). Außerdem erlauben die sequenzbasierten Methoden den einfachen Austausch von Sequenzen als Basis für eine international einheitliche Nomenklatur, die die Nomenklatur der Banden-basierten Methoden einschließlich der Ribotypen ablösen. Für eine gewisse Übergangszeit wird es jedoch für die Verständigung hilfreich sein, wenn zusätzlich zu ST und cgMLST auch Ribotyp-Analoga aus den Genomsequenzen abgeleitet werden. Die meisten Ribotypen können aus Ganzgenomsequenzen abgeleitet werden, so dass die Ribotypisierung als Methode entbehrlich geworden ist. Nicht immer kann aber ein ST/cgMLST genau einem Ribotyp zugeordnet werden, was an der fehlenden verwandtschaftlichen Auflösung der „alten“ Ribotypisierung liegt. So gehört eine Gruppe von Ribotyp 027 Isolaten zum ST1, eine zweite zum ST417 – ohne direkte Verwandtschaft. Diese neue internationale Nomenklatur ist naturgemäß anders als die einfache Nomenklatur der Ribotypen. Die Ganzgenomsequenzierung ist allen anderen genetischen Typisierungsmethoden überlegen und basiert anders als die Banden-basierten Methoden auf einer verwandtschaftsbezogenen Nomenklatur.

Das NRZ hat mehr als 1 Jahr lang parallel Erfahrungen mit Ribotypisierung und Ganzgenomsequenzierung (WGS) gesammelt und die Überlegenheit der WGS einerseits und die Möglichkeit der Berechnung von Ribotyp-Analoga aus den Ganzgenomdaten gezeigt. Seit Januar 2024 erfolgt die Typisierung ausschließlich mittels WGS und nicht mit mehr durch die klassische Ribotypisierung. Die Befunde erlauben die Zuordnung von verwandtschaftsbezogenen ST/cgMLST, zu berechneten Ribotyp-Analoga mit denen der Bezug zum bisherigen Schrifttum hergestellt werden kann und darüber hinaus die charakterisierung von Virulenz- und Resistenzgenen (genotypische Resistenztestung).

Das NRZ C. difficile möchte damit den Bezug zur mittlerweile fast historischen Ribotyp Nomenklatur anbieten und gleichzeitig die moderne Seqenzcharakterisierung mit ihren vielfältigen neuen Anwendungen pflegen und weiterentwickeln.

Diese Technik erlaubt – im Gegensatz zur Ribotypisierung – nicht nur die Einordnung von Erregerisolaten in die (inter)nationale Epidemiologie, sondern ermöglicht mit einer hohen Auflösung auch die Beantwortung der Frage, ob sich bestimmte Erreger(klone) ausbreiten und Ausbrüche und schwere Erkrankungen verursachen. Zudem ist die Reproduzierbarkeit der Ganzgenomsequenzierung deutlich höher, sodass die Ribotypisierung zukünftig vollständig ersetzt wird. Aus historischen Gründen und weil sich die technische Weiterentwicklung in Richtung der Ganzgenomsequenzierung noch nicht international gleichermaßen durchgesetzt hat, wird die Ribotypisierung noch vielfach eingesetzt. Damit eine Rückwärtskompatibilität mit der Ribotypisierung möglich ist, hält das NRZ für ausgewählte Fälle noch die Ribotypisierung zur Verfügung; darüber hinaus entwickelt das NRZ ein Verfahren, um aus Genomsequenzdaten auch den Ribotyp abzuleiten.

Das NRZ bittet weiterhin um die Einsendung von Isolaten oder Stuhlproben, insbesondere bei Ausbrüchen oder meldepflichtigen schweren C. difficile-Fällen. Stuhlproben können auch nach Beginn einer Therapie entnommen und eingesandt werden.

Wenn ein Clostridioides difficileAusbruch in einer Einrichtung vermutet wird, können nach telefonischer Rücksprache die Isolate zur (Sub-)Typisierung kostenfrei an das Referenzzentrum gesendet werden. Diese werden mittels verschiedener Methoden bis hin zur Ganzgenom-Sequenzierung weiter typisiert, um Verwandtschaftsverhältnisse aufzeigen zu können. Beachtet werden muss, dass ein Ausbruchsverdacht bereits meldepflichtig ist. Gerne beraten wir Sie ebenfalls zu hygienischen Maßnahmen im Ausbruchsfall.